Kvantifikacija nukleinskih kiselina u spektrofotometrima
Kvantifikacija nukleinskih kiselina je najčešće korišćena funkcija spektrofotometra. Oligonukleotidi, jednolančna, dvostruka DNA i RNA mogu se kvantifikovati u puferima. Maksimalni apsorpcioni maksimum nukleinske kiseline je 260 nm. Svaka nukleinska kiselina ima drugačiji molekularni sastav i prema tome ima različite konverzijske faktore. Da bi kvantifikovali različite vrste nukleinskih kiselina, prethodno odaberite odgovarajuće koeficijente. Na primer, apsorbancija 1OD je ekvivalentna 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNK i 30 μg / ml Olig, respektivno. Vrednost apsorbance nakon testa pretvara se gorenavim koeficijentom kako bi se dobila odgovarajuća koncentracija uzorka. Prije testiranja izaberite ispravan postupak, unesite količinu osnovnog rastvora i razblaživača i testirajte prazna i uzorka. Međutim, eksperiment nije bio lak. Nestabilna očitavanja mogu biti najveća glavobolja za eksperimentante. Što je senzitivnost instrumenta veća, veći je pokazan gubitak apsorbance.
U stvari, princip dizajna i princip rada spektrofotometra omogućavaju da se vrednost apsorbancije menja u određenom rasponu, odnosno instrument ima određeni stepen tačnosti i tačnosti. Na primer, tačnost biophotometra Eppendorfa ≤ 1,0% (1A). Rezultati ovih višestrukih testova variraju od sredine od 1,0% i sve su normalne. Pored toga, moraju se uzeti u obzir i fizičkohemijske osobine nukleinske kiseline, pH pufera za rastvaranje nukleinske kiseline, koncentracija jona itd. Tokom testiranja, prevelika koncentracija jona takođe će dovesti do čitanja drift kao TE, koji će u velikoj mjeri stabilizirati čitanje. Razblažena koncentracija uzorka takođe je zanemarljiv faktor: zbog neizbežnog prisustva malih čestica u uzorku, posebno uzorcima nukleinskih kiselina. Prisustvo ovih malih čestica ometa testni efekat. Kako bi se minimizirao uticaj čestica na rezultate ispitivanja, apsorpcija nukleinske kiseline je potrebna da bude najmanje 0,1 A, a apsorbancija je poželjno 0,1-1,5 A. U ovom rasponu ne smeju da postoje mehurići u mešavina, i nema suspenzije u praznom. U suprotnom, čitanje nasilno naslanja; istu kolorimetrijsku šolju mora se koristiti za testiranje slepe i uzorka; u protivnom, razlika u koncentraciji je prevelika; koeficijent konverzije i jedinica za koncentraciju uzorka su isti; Kiveta nosi prozor; zapremina uzorka mora da dostigne više od potrebne minimalne količine čaše u boji itd.
Pored koncentracije nukleinske kiseline, spektrofotometar pokazuje nekoliko vrlo važnih odnosa istovremeno kako bi ukazao na čistoću uzorka, kao što je odnos A260 / A280, radi procene čistoće uzorka, s obzirom da je apsorpcioni vrh proteina je 280 nm. Čisti uzorci imaju odnos veći od 1,8 (DNK) ili 2,0 (RNK). Ako je odnos manji od 1,8 ili 2,0, to ukazuje na prisustvo proteina ili fenolnih supstanci. A230 pokazuje da u uzorku postoje neki zagađivači, kao što su ugljeni hidrati, peptidi, fenoli itd. Odnos čistih nukleinskih kiselina A260 / A230 je veći od 2.0. A320 otkriva zamućenost rješenja i druge faktore smetnji. Čisti uzorak, A320 je generalno 0.
Kompanija je specijalizovana za prodaju spektrofotometara , dobrodošlih kupaca koji imaju potrebu za konsultacijom i kupovinom, pružićemo vam iskrenu uslugu i kvalitetne proizvode, kao i niže cene.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com