Spektrofotometrijska kolorimetrična kvantifikacija proteina
Proteini su obično mješavina proteina. Kolorimetrijski testovi se zasnivaju na sastavima proteina: Amino kiseline (npr. Tirozin, serin) reaguju sa dodatnom hromogenom grupom ili bojom da bi se proizvelo obojeni materijal. Koncentracija obojenog materijala je direktno povezana sa brojem amino kiselina koje reaguje protein, čime se reflektuje koncentracija proteina.
Kolorimetrijska metoda
Postoji nekoliko metoda kao što su BCA, Bradford i Lowry.
Metoda Lowry: Zasnovana na najranijoj Biuret reakciji i poboljšana. Protein reaguje sa Cu2 da proizvodi plavu reakciju. Međutim, Lowryov metod je osetljiviji od Biureta. Nedostatak je potreba da se uzastopno dodaju nekoliko različitih reagensa; reakcija traje dugo; je podložan ne-proteinskim supstancama; proteini koji sadrže EDTA, Triton x-100 i amonijev sulfat nisu pogodni za ovaj metod.
Analiza bicinhoniinske kiseline: Ovo je noviji, osjetljiviji proteinski test. Protein koji se analizira reaguje sa Cu2 u alkalnom rastvoru kako bi se proizvela Cu, koja formira helat sa BCA i formira purpurno jedinjenje sa vrhom apsorpcije na 562 nm. Linearni odnos između koncentracije ovog jedinjenja i proteina je jak, a jedinjenje formirano nakon reakcije je vrlo stabilno. U odnosu na Lowry metod, operacija je jednostavna i osjetljivost je visoka. Međutim, slično metodu Lowry, ona je podložna mešanju s proteinima i deterdžentima.
Bradfordova metoda: Princip ove metode je da protein reaguje sa Coomassie Brilliant Blue da proizvodi obojeno jedinjenje koje apsorbuje na 595 nm. Njegova najveća karakteristika je njegova osjetljivost, što je 2 puta veća od Lowry i BCA. Jednostavnije je i brže. Potrebna je samo jedna vrsta reagensa reakcije. Jedinjenje može biti stabilno 1 sat kako bi se olakšao rezultat; Interferirajući se sa Lowry, BCA reaguje sa redukcionim agensima (npr. DTT, merkaptoetanolom) kompatibilnim. Međutim, i dalje je osetljiv na deterdžente. Glavni nedostatak je u tome što različiti standardi mogu dovesti do velikih razlika u rezultatima istog uzorka i nema uporedivih rezultata.
Neki istraživači koji su prvi put izloženi kolorimetrijskim merenjima mogu biti zbunjeni rezultatima različitih kolorimetrijskih testova. Kakve metode verujete da ste zbunjeni? Zbog činjenice da su grupe reagovale na različite načine, a hromogene grupe nisu iste, istovremeno se koriste nekoliko metoda kako bi koncentracije uzoraka istog uzorka bile nekonzistentne. Na primjer, Keller et al. testirali su protein u ljudskom mleku i utvrdili da su koncentracije merene Lowry-om i BCA-om značajno veće od Bradford-a. Razlika je bila značajna. Čak i ako se odredi isti uzorak, standardni uzorak odabran istom kolorimetrijskom metodom je nedosledan, a koncentracija nakon testa je takođe nedosledna. Na primer, koristite Lowry za testiranje proteina u homogenatu ćelije, koristeći BSA kao standard, sa koncentracijom od 1,34 mg / ml i globulin kao standard sa koncentracijom od 2,64 mg / ml. Prema tome, pre izbora kolorimetrijskog metoda, poželjno je da se pozovemo na hemijski sastav uzorka koji se testira i pronađemo hemijski sličan standardni protein kao standard. Pored toga, kolorimetrijska metoda za kvantifikaciju proteina često uzrokuje probleme jer je apsorbanciona vrijednost uzorka preniska, što rezultira velikom razlikom između izmerene koncentracije uzorka i stvarne koncentracije. Ključno pitanje je da boja važnog dela 1011 spektrofotometra, kivete, ima određeni polu-život, pa svaka kolorimetrijska metoda navodi vreme testiranja reakcije. Svi uzorci (uključujući standardne uzorke) moraju biti testirani u ovom trenutku. Ako je vreme predugo, dobijena vrednost apsorbance postaje manja i pretvara se koncentracija koncentracije. Pored toga, reakciona temperatura, pH vrednost rastvora itd. Su svi važni faktori koji utiču na eksperiment. Pored toga, veoma je važno koristiti plastičnu kolorimetriju. Izbegavajte upotrebu kiveta napravljenih od kvarca ili stakla, jer boja nakon reakcije će izazvati obojenje kvarca ili stakla, što rezultira netačnom apsorpcijom uzorka.
Kompanija je specijalizovana za prodaju spektrofotometara , dobrodošlih kupaca koji imaju potrebu za konsultacijom i kupovinom, pružićemo vam iskrenu uslugu i kvalitetne proizvode, kao i niže cene.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com