Uvod u načelo i primjena općih komponenti spektrofotometra

Spektrofotometar se široko koristi u biološkim, hemijskim, kliničkim i ekološkim istraživanjima.
Spektrofotometrija mjeri koliko svjetlosti kemikalija može apsorbirati prolazeći snop svjetlosti kroz uzorak u spektrofotometru.
Merenjem otkrivenog intenziteta svetlosti, metoda se može koristiti za određivanje koncentracije rastvora u uzorku.
Koncept spektrofotometrije
Zraka poslata uzorku sastoji se od fotonske zrake.
Kad se fotoni susretnu s molekulama u uzorku, molekuli mogu apsorbirati neke od njih, smanjiti broj fotona u snopu i smanjiti intenzitet detekcijskog signala.
Prodajni deo je deo svetlosti koji prolazi kroz uzorak. Definiše se kao intenzitet svjetlosti koji prolazi kroz uzorak pri intenzitetu upadne svjetlosti.
Apsorbancija je suprotna propusnosti, koja odgovara količini izmjerenoj spektrofotometrom.
Prema apsorbanciji koncentracija uzorka otopine može se odrediti iz zakona Lambertovog zakona, koji pokazuje da postoji linearni odnos između apsorbancije i koncentracije uzorka. Prema Lambertovom zakonu o pivu, apsorbancija je proizvod koeficijenta apsorpcije, koji je mjera količine svjetlosti apsorbirane rastvorenom na određenoj talasnoj dužini i udaljenosti kroz koju svjetlost prolazi. Uzorak ili putna udaljenost i koncentracija rastvora. Općenito, cilj mjerenja apsorbancije je mjerenje koncentracije uzorka.
Komponente spektrofotometra
Svaki spektrofotometar sastoji se od izvora svjetlosti, kolimatora (sočiva ili uređaja za fokusiranje za prijenos jakih i ravnih zraka), monokromatora za razdvajanje snopa različitih valnih duljina i selektora duljine za odabir vala ili žljebova željene valne duljine. Talasna dužina svjetlosti koja se koristi u spektrofotometru predstavljenom u ovom videu nalazi se u rasponu ultraljubičastog i vidljivog svjetla. Spektrofotometar također uključuje držač uzorka, fotodetektor i ekran na kojem se prikazuju rezultati detektora.
Najnoviji spektrofotometar direktno je povezan s računarom, gdje se mogu kontrolirati eksperimentalni parametri i prikazati rezultati.
Princip rada spektrofotometra
Prilikom provođenja spektrofotometrije važno je poduzeti odgovarajuće mjere opreza, poput nošenja rukavica, ovisno o vrsti biološke ili kemijske otopine koju koristite.
Uključite uređaj i pustite da se lampa i elektronika greju pre merenja UV-Vis spektra uzorka.
Pripremite prazan uzorak iste otopine s istim pH i sličnom ionskom snagom, ali bez komponenti koje se analiziraju; obzirom da kiveta i otapalo mogu raspršiti svjetlost, potrebno je analizirati uzorak.
Tradicionalni držač za uzorak spektrofotometra dizajniran je za držanje plastičnih i kvarcnih posuda. Originalno rješenje stavite u posudu.
Nakon što obrišete sve otiske prstiju i prskate ih po vanjskoj strani posude, pravilno umetnite kivetu u držač uzorka i zatvorite vrata poklopca.
Nikada ne zaboravite da zatvorite vrata, jer UV zračenje sa otvorenog spektrofotometra može oštetiti vaše oči i kožu.
Programirajte željenu valnu duljinu ili raspon valnih duljina koji će se prenijeti na uzorak. To ovisi o najboljoj valnoj dužini koju komponenta koja se analizira može apsorbirati. Potom se stroj nulaira mjerenjem praznog uzorka, koji oduzima dno apsorbancije zbog pufera uzorka.
Ovisno o vrsti eksperimenta spektrofotometrije koji radite, možda će biti potrebno generirati standardnu krivulju prije mjerenja uzorka, iz koje se može odrediti koncentracija spoja analiziranog u uzorku.
Pustite da uzorak dostigne odgovarajuću temperaturu i lagano promiješajte da ne bi došlo do stvaranja mjehurića. Uzorak se zatim može dodati direktno u posudu unutar mašine i može se očitati.
Nakon što je uzorak izmeren za apsorbanciju, eksperiment se pravilno izračunava; na primjer, za određivanje nivoa koncentracije ili aktivnosti enzima.
Primjena spektrofotometra
Jedna od uobičajenih primjena spektrofotometra je mjerenje gustoće ćelija. Mjerenje ćelijske gustoće može se koristiti za proizvodnju logaritamske krivulje rasta bakterija iz koje se može odrediti optimalno vrijeme za integraciju rekombinantnog proteina.
Spektrofotometar se takođe može koristiti za mjerenje brzine hemijske reakcije. U ovom utjelovljenju, apsorbancija se koristi za nadgledanje enzimske reakcije, koja s vremenom nestaje kroz intermedijarnu reakciju od 452nm. Brzina ovog enzimatskog koraka može se izračunati upoređivanjem podataka s odgovarajućom jednadžbom.
Uvođenjem mikro spektrofotometra eliminira se potreba za držačem uzorka. Ovi spektrofotometri koriste površinsku napetost za održavanje uzorka.
Mikrospektrofotometar je najbolji izbor za mjerenje mase i koncentracije malih i skupih uzoraka, poput biomolekula, uključujući proteine i nukleinske kiseline.
Apsorbancija proteina na 280 nm ovisi o sadržaju aromatskih bočnih lanaca koji se nalaze u triptofanu, tirozinu i fenilalaninu, kao i disulfidnoj vezi između dva cisteina.
Koncentracija proteina može se odrediti njegovom apsorpcijom na 280nm i koeficijentom apsorpcije koji se temelji na sastavu aminokiselina.
DNK i RNA imaju maksimalnu apsorbanciju na 260 nm, iz koje se mogu odrediti njihove koncentracije. Čistoća nukleinskih kiselina također se može procijeniti iz omjera očitavanja apsorpcije prema specifičnim valnim duljinama.